SARS CoV 是非自然方式产生的

作者：徐德忠 张景霞 张 磊 孙慧敏  来源：《医学争鸣》2014年第1期

我们已分别从概况和流行病学反常分布等方面阐明SARS CoV非自然起源的理由[1-2]。本文将描述其系统发育和“逆向进化”；正由此使我们考虑到，其直接祖先为非自然进化而来。因此，①揭示2003年底至2004年初广州爆发SARS CoV与2002〜2003年流行早期病毒之亲缘较晚期更近以及流行中其阳性选择压逐渐下降；②揭示其受体结合位点重要氨基酸的变异及其逆向进化；③揭示其和Bt-SLCoV（蝠SARS样冠状病毒）基因ORF8特征性29-nt之差异及其缺失和逆向进化；④揭示其基因ORF1ansp3的CDS（编码序列）（SUD：SARS CoV特有CDS）之变异并呈逆向进化趋势。这些论述十分重要，为证明其非自然起源之关键。

1、生物系统发育中的逆向进化

Bull最早定义逆向进化：“相同特征的分枝群体，经包括适应在内的方式，再获得祖先群体的特征[3]”；Teotcfnio[4]精简为“再获得祖先状态”。实际上，逆向进化在生物界随处可见，但除少数涉及人类生活事件外，不易引起人们的注意[3-5]。由于条件受限等，目前多见其实验和理论研究，尤其是对微生物、原生动物和昆虫[3-8]。但也有和人类环境密切相关的广泛研究个例：19世纪欧美工业空气污染和20世纪治理引起的胡椒蛾桦尺蠖由淡色变黑又变回的逆向进化，研究已进行几十年，最近仍有报道[6-8]。我们认为，逆向和顺向进化共同形成了生物进化。

中医阴阳学说认为，世界包括人体健康和疾病、人群发病和流行均在阴阳二气相互作用下发生发展，二者既相互对立又相互统一[9]。可见，逆向进化也符合哲学和医学的基本理论。

2、SARS CoV经历的逆向进化

以此为指导，我们重新研究、比较分析了国内外的大量工作[10-29]。虽然学者们对结果做了深人的常规分析，有具体的新发现，但对于SARS CoV跨种的确切机制和贮存宿主，均言：“需进一步研究”；对其直接祖先，同声：“应全面搜索”。而本文以另一角度揭示了其逆向进化之规律，为探讨真实起源打下科学基础。

2.1 2003~2004年广州爆发SARS CoV与2002〜2003年流行早期病毒之亲缘较晚期更近以及流行中其阳性选择压逐渐下降

国际上将2002~2003年流行分成早、中和晚期[1，2,19,29]。关于“2003~2004年广州爆发SARS CoV与2002~2003年流行早期病毒之亲缘较晚期更近”，已报道[1]。

适应性进化通常以非同义置换速率与同义置换速率比值（Ka/Ks）（theratiosoftheratesofnonsynonymoustosynonymous）衡量。若Ka/Ks>1，良P具阳性选择压；若Ka/Ks<1，即处净化选择，不适应的序列将被淘汰。学者们早在《Science》杂志上，分析了SARS CoV进化过程，从早经中至晚期，其Ka/Ks总体上逐渐下降。两两分析显示：①S和ORF1a基因类似：初受强烈阳性选择压力，后为净化选择并最终稳定；②而ORFlb流行全过程似均经历净化选择；但该序列为基因组最保守的区域。此令人深省！该文作者特别指出：这是一非凡的进化历程，但其机制需进一步研究[29]。

在此，结合SARS CoV根本不存在贮存宿主和其流行后已从自然界与人群消失之现实，本文应用此理论，解释上述选择性适应和净化过程所致非凡进化历程的机制：①由于ORF1b为病毒基因组最保守区域，在正常进化中，其序列被淘汰的概率应远低于S等基因，但实际却相反，为进化史之反常；②ORF1b序列的某些核苷酸被淘汰，从流行病学理论判断：其不适应人类；③最保守序列不适应人类，原因可能仅一个：其经历了“非自然进化”[1]，即基因改造；④SARS CoV进人人类后，必遭强大压力，必以逆向进化应对，表现为全过程经历净化选择。《Science》之问由此迎刃而解。

2.2 SARS CoV受体结合位点重要氨基酸出现逆向进化

目前公认，Bt-SLCoV是SARS CoV隔数代的共同祖先，尤其是Rp3株（亲代3）[20-21，30]。我们研究SARS CoV受体结合位点重要氨基酸（AA）时发现，和SARS CoV传播力密切相关、与患者（人）或果子狸（狸）受体血管紧张素转换酶2（ACE2）之结合位点为S1318-510位点[16,19-20,22-24,31]。其中，487、479两位AA尤为重要；已用突变、变异和比对、免疫试验、嵌合ACE2和X射线晶体学等实验进行了验证。Li等指出487、479两位AA之作用：2002~2003年流行中若变异，如（N479K）增加电荷和关键甲基基团（T487S）缺失，即像2003~2004年广州爆发人和狸株那样，则其和ACE2的亲和力差1000倍以上[23-26]。其宗旨为寻找跨种传播的突变热点；由于未用甚至未知“逆向进化”理论，对起源仍仅寄托于“未来研究”，但却在客观上为我们逆向进化的研究提供了依据。

在此，我们将487、479两位AA，从祖先Bt-SLCoV开始，经2002~2003年流行至2003~2004年广州爆发狸和人SARS CoV的变异历程进行综合分析（表1）。发现：479位AA：在Bt-SLCoV（亲代3）为S（丝氨酸）；至2002~2003年流行时狸株，为另3种同时存在：R（精氨酸）、K（赖氨酸）、N（天冬酰胺）；而人株，仅1种：N。令人惊异：2003-2004年广州爆发时狸株仅为原先的2种：R、N;人株却增至3种，和2002-2003年流行时狸株相同：R、K和N。487位AA也类似：Bt-SLCoV为V（缬氨酸）；至2002~2003年流行时狸株为S;人株为T（苏氨酸）。同样令人惊异：2003~2004年广州爆发时人和狸同，均为S。

很显然，两位AA从祖先开始，至广州爆发止，其进化经一或多种不完全的历史回复：蝠株（亲代3）---?（亲代2）---?（亲代1）---2002~2003年狸株---2002-2003年人株---2003-2004年狸株---2003-2004年人株[1]。该过程很可能更复杂曲折。然而，方向仅一个：2003〜2004年人株向2002-2003年狸株回复，再结合前文广州爆发病例的临床和流行病学特点[1-2]，不难推断SARS CoV经历了逆向进化。Janies等[31]专门构建了不同宿主SARS CoV或Bt-SLCoV487、479位AA的系统发育树。从中，可更清楚地了解我们的观点。

3、SARS CoVORF8特征性29-nt存在逆向进化

人和狸SARS CoV基因组，除前述的主要基因外，具独特的附属基因，即ORF8，后者含特征性29-nt序列：CCTACTGGTTACCAACCTGAATGGAATAT（nt.27869-27897）。早在2003年学者发现，除2002-2003年流行早期极少数患者外，特征性29-nt在大部分病例中缺失。故将此谓特征性29-nt缺失，并认为其和SARS CoV从动物至人类的适应性有关[32]。此后研究[19,29-31，33-35]，证实其可能与SARS CoV复制、致病性与跨种传播等有关。鉴于此，我国学者发表文章，特别画出ORF7b-ORF8之RNA二级结构，且将GZ02（存在29-nt）和TOR2（缺失）2株病毒进行比较[29]。

无独有偶，Bt-SLCoV同样存在ORF8特征性29-nt序列：CCAATACATTACTATTCGGACTGGTTTAT（nt.27866-27894），且①仅在蝠内，为其特有；②和宿主蝠联系紧密；③和人-狸29-nt序列相比，位点提前3位，呈直系基因位置关系，有12位nt呈多态性。为易表述和区别，我们谓其“原29-nt”；人-狸nt.27869-27897，称为“变29-nt”。我们进一步发现，如同前述487、479两位AA—样，ORF829-nt在进化历程中，有十分类似的逆向进化（表1）。狸株均为“变29-nt”，但人株，除2002~2003年流行最早期少数外，绝大部分均缺失；而至2003~2004年广州爆发，却又回复“变29-nt”，如同狸株，呈现典型的逆向进化。

上述3点，仅为我们发现的主要逆向进化，但肯定还有更多未知数。如上述，SARS CoV或某些Bt-SLCoV有一独特的CDS，即SUD[14，19，36]。SUD具357个AA，3个亚结构域；其参与调节病毒复制或抵抗受感染宿主的免疫反应。Song等[19]指出，2003~2004年广州爆发人株的ORF1ant.6295突变，导致SUD出现终止密码子；并认为其和病例的症状轻与传染性低有关。又如前述，他们的目标欲证明：广州爆发为区别于2002~2003年流行的独立事件，但客观上却提供了逆向进化又一证据。因SUD功能减弱或丧失，反映SARS CoV不能适应人群，发生回复变化。

但需指出，SARS CoV逆向进化的方式和以往有非常明显的差异，甚至史无前例。因为：①SARS CoV的进化并非完全在生物界和人类中进行；②其曾经非自然进化处理；③其寿命之短，在同类病毒甚至病毒界，可能绝无仅有；④人群流行中，其毒力和传播力变异相当悬殊：强时致病8098例，亡774例，现有许多超级传播者，波及全球；弱时仅一城市致4例，无续发；两者之间时隔仅半年，为生物界传染病史之一瞬；但实验室毒株的毒力和传播力却未变。到此，应该回答下一问题：SARS CoV为何出现逆向进化，又如何与其起源和消失有关？

4、SARS CoV逆向进化的原因及其起源与消失之框架

虽逆向进化是生物进化中的正常过程，普遍存在，但我们对其知之甚少。超乎常识，逆向进化可呈顽强的表现，如估计，鲸类后肢返祖的能力约可保留107代，但不可逆性仅存很短时间[4,37]。所以，SARS CoV呈现逆向进化不足为奇。

逆向进化的直接原因很复杂，主要为生存环境发生了变化。我们归纳，可能有3点：①若群体迁人新环境时间很短，其易保持祖先环境产生的永久遗传变异；②返回祖先状态时，基因型中有利于祖先环境变异的频率增加；③新环境中，新的选择变异株少，新选择性差，利于逆向进化。

为解答SARS CoV逆向进化的具体原因，必须回顾其进化和所致流行之要点〜2]：①其最早祖先可能为Bt-SLCoV，共同祖先时间约在爆发前4.5年，而HIV从源病毒至人，约经700~800年；②至今未发现其直接祖先和贮存宿主；③2002~2003年流行仅持续8~9个月，并无疫苗预防，且爆发和消失的时间点均突然；④其和其他CoV所致病的流行病学及临床特点相去甚远；⑤其和新发传染病的病毒进化与流行之普遍规律不符；⑥其呈现许多逆向进化；⑦流行后10年再未见病例和动物受染。至此，一条证据链形成：SARS CoV是“非自然”所致，即由Rp3株或类似毒株经非自然改造所致，否则不能解释上述诸点。

因此，进人新宿主后，不断受到强大逆向进化之压力。由于：①离祖先病毒株仅约4年多时间，故其产生后，不可能在人类亲缘很近的动物群内做适应试验；②同理，迅即进人全新环境，易保持祖先环境的永久遗传变异；③新宿主中，其新的选择条件差，未见许多新亚型；而阳性选择压不断降低，利于祖先环境变异的频率增加。所以，其进人人群后，特征性29-nt序列迅速丢失；现一系列逆向进化；一年后毒力和传播力明显下降，不久即在人类和自然界消失。这应是其最好的归宿。

根据上述的论证，我们构建了“SARS CoV的起源和进化”框架图（图1）。

关于图1，还需强调一要点，即非自然（基因）改造技术及其应用。虽然我们均已描写[1-2]，但很多读者、甚至学者对此仍未完全了然。图1个别环节还需完善和修改，但在总体上可合理地解释以上疑问和事实。

①图中框分二层:上层为SARSCoV的起源和进化流程，下层除“实验室感染”外，为上层框内容之描述；②487、479：SARSCoV或Bt-SLCoVS1区487、479两位AA，数字前或后的英文为AA之种类；③原29-nt，变29-nt，无29-nt：分别代表其特征性29-nt序列：CCAATACATTACTATTCGGACTGGTTTAT（nt.27866-27894），CCTACTGGTTACCAACCTGAATGGAATAT（nt.27869-27897）和缺失；④SUD，终码SUD：分别代表nt.6295突变出现终止密码子前后的SUD；⑤毒株：早GZ02GD01:2002~2003年流行早期2人株；晚Tor2：晚期人株；狸SZ3：早期1狸株；2004年GZ04：2003~2004年广州爆发人株；PC04:为其狸株。特别说明：这些毒株应看作为该期毒株的代表；⑥实验室感染。其次，目前自然界己不存在SARSCoV，仅贮存实验室。

图1“SARSCoV的起源和进化”框架图

本文可得如下结论：①在人类动物源性传染病发展史上，我们首次提出由非完全动物源性导致该病全球流行之可能；②人类实际已进人利用非自然（基因）改造技术产生新病毒并使之在人群中流行的时代，应引起WHO和全世界的共同关注；③逆向进化理论在指导人们认识传染病起源方面可发挥重要作用。

由于事关人类健康和全球安全，通过本文之研究，我们专业学者有责任、有义务，再次吁请我国卫生和计划生育委员会正式向WHO提出建议：组织一个专家委员会，和有关国家合作，完成两项任务：①对人群和动物群体进行调查研究，实证SARS CoV已经从中消失，并正式宣布：人类历史上已消灭了第二种传染病——SARS，以使公众安心；也慰籍无私奉献、专业超群的科学家Dr.CarloUrbani，他是判定SARS爆发的首位WHO官员，后在岗位上受染而牺牲[11,38]②在专门实验室，验证某些必要的非自然（基因）改造技术。

致谢：我校陈景元、闫永平、夏洁来和陈长生教授，王波和樊家勇副教授，苏春萍副研究馆员的支持或帮助。

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